Découverte et optimisation d’inhibiteurs pour des enzymes DfrBs impliquées dans la résistance bactérienne

Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique utilisé en clinique ainsi que de façon préventive dans l’élevage de bétail et l’aquaculture, causant une pression sélective auprès des bactéries. La cible de cet antibiotique est l’enzyme dihydrofolate réductase (Dfr) bactérienne chromosomique qui est essentielle dans la voie de biosynthèse du folate et donc, à la prolifération cellulaire. Plusieurs types de résistances au TMP furent répertoriés, dont le transfert d’un plasmide de résistance entre bactéries pathogènes. En fait, dans le milieu hospitalier, ce plasmide est le plus dangereux, puisque ce milieu est propice à une plus forte sélection provoquant la prolifération des bactéries résistantes au TMP. Des bactéries pathogènes résistantes au TMP possédant les gènes de Dfr de type B (dfrB) ont été identifiées dans l’aquaculture des poissons, l’élevage de bétail ainsi que dans les eaux usées. Les gènes des dfrBs sont normalement répertoriés indirectement par l’identification des éléments des intégrons. Ceci fait en sorte que la prévalence des gènes des dfrBs est sous-estimée. Il est impératif de déterminer la prévalence de ces gènes. Nous avons démontré le potentiel d’accomplir ceci par une recherche directe de ces gènes dans des échantillons cliniques Nord-Américains de Escherichia coli (E. coli) résistants au TMP. À ce jour, aucun antibiotique n’est répertorié pour vaincre la résistance causée par les DfrBs. En fait, peu de travaux sont effectués sur cette famille émergente. Nous savons que les DfrBs ne possèdent aucune similarité de séquence ni de structure avec les Dfr chromosomiques procaryotes et eucaryotes. Il est d’une grande importance de développer des inhibiteurs sélectifs envers ces enzymes pouvant potentiellement servir d’antibiotiques. Éventuellement, une bithérapie avec le TMP et ce nouvel antibiotique augmentera l’efficacité antibactérienne du TMP. Pour y arriver, nous avons déployé plusieurs moyens dont la continuité de la conception d’inhibiteurs basée sur les fragments (FBLD) qui fût rapportée précédemment, la conception d’inhibiteurs visant deux cibles thérapeutiques basée sur la structure des substrats ainsi que le criblage à haut débit d’une librairie d’extraits d’invertébrés marins. Puisque la DfrB1 est la plus étudiée de la famille des DfrBs, nous l’utilisons comme modèle pour ces approches dans la découverte et l’optimisation des inhibiteurs. Lors de l’optimisation des inhibiteurs issus du FBLD, nous avons obtenu des indices provenant du mode de liaison de ces inhibiteurs à la cible enzymatique et de la caractérisation biophysique de cette liaison afin de diriger les efforts de synthèse de ceux-ci. Ainsi, les connaissances des domaines de l’enzymologie et de la pharmacologie nous permettent de comprendre le mode de liaison de ces inhibiteurs. Les DfrBs possèdent une similitude de séquence protéique de 77% - 100%. À notre connaissance, aucune caractérisation cinétique des autres membres des DfrBs n’a été effectuée. En fait, pour la plupart des membres, aucune confirmation n’a été obtenue concernant la corrélation de la résistance au TMP. Nous confirmons leur activité dihydrofolate réductase ainsi que leur faible sensibilité au TMP. Avec ces résultats encourageants, nous proposons un mode d’inhibition similaire entre elles. Ainsi, les inhibiteurs de la DfrB1 testés démontrent aussi une inhibition pour les DfrBs et ce, avec la même amplitude. Nos avancées indiquent qu’il serait possible de détenir une tête de série inhibant tous les membres de cette famille.Trimethoprim (TMP) is a widely used antibiotic, both clinically as well as preventively in livestock farming and aquaculture. This broad usage causes selective pressure on bacteria. The target of this antibiotic is the chromosomal bacterial dihydrofolate reductase enzyme (Dfr), which is essential in the folate biosynthesis pathway and, therefore, in cell proliferation. Several types of resistance to TMP have been identified, including the transfer of an antibiotic-resistant plasmid between pathogenic bacteria. In clinical environments, this plasmid is of great concern, since this environment is conducive to a greater selective pressure causing the proliferation of TMP-resistant bacteria. TMP-resistant pathogenic bacteria with the plasmids carrying Dfr type B genes (dfrB) have been identified in aquaculture, livestock and wastewater. The dfrBs genes are normally tracked indirectly by the identification of integron elements underestimating the prevalence of dfrBs genes. Because it is imperative to determine the prevalence of these genes, we have demonstrated the possibility to determine their prevalence by the direct search of these genes in a North American library of TMP-resistant clinical samples. To date, no antibiotics are known to overcome the resistance caused by DfrBs. In fact, there is limited data on this emerging family. We know that DfrBs are evolutionarily and structurally unrelated to prokaryotic and eukaryotic chromosomal Dfrs. It is of great importance to develop selective inhibitors for these enzymes that could subsequently serve as potential novel antibiotics. Eventually, dual therapy with TMP and this new antibiotic could increase the antibacterial effectiveness of TMP. In order to develop such molecules, we have deployed several approaches including a follow-up of previously reported fragment-based lead design (FBLD), the design of substrate analogs as inhibitors targeting two therapeutic enzymes, as well as high-throughput screening of a library of marine invertebrate extracts. Since DfrB1 is the best studied among the DfrB family, it was used as a model for these approaches. In the optimization of inhibitors from FBLD, we studied the inhibitor’s mode of binding to direct synthetic efforts for the next generation of potential inhibitors. Thus, knowledge in the fields of enzymology and pharmacology enhances our understanding of the mode of binding of these inhibitors. Members of the DfrB family share 77% to 100% protein sequence similarity. To our knowledge, no kinetic studies of DfrB members other than DfrB1 have been performed. For most members, the correlation of TMP resistance and their source have not been confirmed. We confirm their dihydrofolate reductase activity as well as their resistance to TMP. With these encouraging results, we propose a similar mode of inhibition for all DfrBs. We demonstrate that inhibitors of DfrB1 also inhibit other DfrBs. Our advances indicate that it would be possible to have a lead compound that inhibits all members of this family

Transglutaminase-Catalyzed Bioconjugation Using One-Pot Metal-Free Bioorthogonal Chemistry

General approaches for controlled protein modification are increasingly sought-after in the arena of chemical biology. Here, using bioorthogonal reactions, we present combinatorial chemoenzymatic strategies to effectuate protein labeling. A total of three metal-free conjugations were simultaneously or sequentially incorporated in a one-pot format with microbial transglutaminase (MTG) to effectuate protein labeling. MTG offers the particularity of conjugating residues within a protein sequence rather than at its extremities, providing a route to labeling the native protein. The reactions are rapid and circumvent the incompatibility posed by metal catalysts. We identify the tetrazine ligation as most-reactive for this purpose, as demonstrated by the fluorescent labeling of two proteins. The Staudinger ligation and strain-promoted azide–alkyne cycloaddition are alternatives. Owing to the breadth of labels that MTG can use as a substrate, our results demonstrate the versatility of this system, with the researcher being able to combine specific protein substrates with a variety of labels

Fragment-Based Design of Symmetrical Bis-benzimidazoles as Selective Inhibitors of the Trimethoprim-Resistant, Type II R67 Dihydrofolate Reductase

The continuously increasing use of trimethoprim as a common antibiotic for medical use and for prophylactic application in terrestrial and aquatic animal farming has increased its prevalence in the environment. This has been accompanied by increased drug resistance, generally in the form of alterations in the drug target, dihydrofolate reductase (DHFR). The most highly resistant variants of DHFR are known as type II DHFR, among which R67 DHFR is the most broadly studied variant. We report the first attempt at designing specific inhibitors to this emerging drug target by fragment-based design. The detection of inhibition in R67 DHFR was accompanied by parallel monitoring of the human DHFR, as an assessment of compound selectivity. By those means, small aromatic molecules of 150–250 g/mol (fragments) inhibiting R67 DHFR selectively in the low millimolar range were identified. More complex, symmetrical bis-benzimidazoles and a bis-carboxyphenyl were then assayed as fragment-based leads, which procured selective inhibition of the target in the low micromolar range (<i>K</i>_i = 2–4 μM). The putative mode of inhibition is discussed according to molecular modeling supported by in vitro tests